蛋白纯化步骤(蛋白纯化流程图)

健康养生 2023-08-31 21:04:01

生活的过程中，小伙伴们是不是经常遇到一些很困惑的问题，比如我们今天要说的蛋白纯化步骤(蛋白纯化流程图)这个问题，要解决这样的问题其实很简单，下面可以跟着小编来具体了解一下吧。

蛋白纯化步骤(蛋白纯化流程图)

蛋白质纯化是生物研究领域的一项重要技术。为了研究一种特殊的蛋白质，我们必须首先从有机体中分离和纯化蛋白质。蛋白质纯化方法主要利用不同蛋白质之间的异同，可以根据蛋白质之间的相似性去除非蛋白质物质，然后根据蛋白质中的差异分离出目标蛋白质。本文将介绍两种常用的蛋白质纯化方法。

镍柱亲和色谱

1.自制简易柱，直径1cm左右，长2cm。向柱的下端加入蒸馏水，并关闭柱的出口。

2.将琼脂糖凝胶倒入柱中，让填充物自然沉降，依次用无菌水、8mol/L尿素和无菌水冲洗柱子。

3.缓慢加入5ml硫酸镍，直至柱子颜色由白色变为蓝色，直至蓝绿色收集液滴下。

4.用2至5倍体积的PBS缓冲液平衡柱子，然后上样粗蛋白样品，以约1ml/min的流速通过梯度浓度为50mmol/L、70mmol/L、150mmol/L和250mmol/L咪唑的柱子。

5.收集每个浓度为1.5ml的Eppendorf的八个试管，然后用2至5倍体积的无菌水冲洗柱子，然后用2至5倍体积的50mmol/L EDTA冲洗柱子，以除去NiSO4 _ 4，直至其无色。

6.用多倍体无菌水洗柱，用SDS—PAGE分析手机液的10%分离胶。

离子交换层析

1.均匀混合macro prep高Q强阴离子交换填料，吸取16 ml到小烧杯中，静置直到填料沉淀到烧杯底部，吸取并丢弃上清液。

2.向烧杯中加入4倍体积的ddH2O，混合均匀，静置，沉淀后除去上清液。重复2次，充分洗去保存的填充物中的乙醇。

3.向空柱中加入10%的上柱缓冲液，静置以去除可能存在于柱壁和柱底膜上的气泡。

4.以1:1(v/v)的比例在烧杯中加入柱加载缓冲液(20 mm磷酸钠，pH 7.0，1 m NaCl)，并充分混合。用玻璃棒排干并加入到柱中，用柱加载缓冲液填充剩余的柱体积。静置30分钟。

5.当所有填料都沉淀在色谱柱底部后，以小倾角将适配器插入色谱柱填料的顶部。

(1)打开色谱柱下端的开口，以10 ml/min的最大流速泵入色谱柱上样缓冲液，并压紧填料。

(2)缓慢降低缓冲液流速，用结合缓冲液(20 mM磷酸钠，pH 7.0)代替上柱缓冲液。

(3)设置蛋白纯化程序，用15倍柱体积缓冲液线性梯度洗脱目的蛋白。

(4)收集流出液，用SDS-PAGE检测。

(注:色谱所需的溶液和蛋白质样品都需要用0.22微米滤膜过滤，少量溶液或蛋白质样品需要用针式过滤器过滤，大量溶液需要用506溶剂过滤器过滤。)

结束

注：本推文首发“科研日精进” *** 公众号