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2023-12-26 06:40:01
蛋白质纯化是生物研究领域的一项重要技术。为了研究一种特殊的蛋白质,我们必须首先从有机体中分离和纯化蛋白质。蛋白质纯化方法主要利用不同蛋白质之间的异同,可以根据蛋白质之间的相似性去除非蛋白质物质,然后根据蛋白质中的差异分离出目标蛋白质。本文将介绍两种常用的蛋白质纯化方法。
镍柱亲和色谱
1.自制简易柱,直径1cm左右,长2cm。向柱的下端加入蒸馏水,并关闭柱的出口。
2.将琼脂糖凝胶倒入柱中,让填充物自然沉降,依次用无菌水、8mol/L尿素和无菌水冲洗柱子。
3.缓慢加入5ml硫酸镍,直至柱子颜色由白色变为蓝色,直至蓝绿色收集液滴下。
4.用2至5倍体积的PBS缓冲液平衡柱子,然后上样粗蛋白样品,以约1ml/min的流速通过梯度浓度为50mmol/L、70mmol/L、150mmol/L和250mmol/L咪唑的柱子。
5.收集每个浓度为1.5ml的Eppendorf的八个试管,然后用2至5倍体积的无菌水冲洗柱子,然后用2至5倍体积的50mmol/L EDTA冲洗柱子,以除去NiSO4 _ 4,直至其无色。
6.用多倍体无菌水洗柱,用SDS—PAGE分析手机液的10%分离胶。
离子交换层析
1.均匀混合macro prep高Q强阴离子交换填料,吸取16 ml到小烧杯中,静置直到填料沉淀到烧杯底部,吸取并丢弃上清液。
2.向烧杯中加入4倍体积的ddH2O,混合均匀,静置,沉淀后除去上清液。重复2次,充分洗去保存的填充物中的乙醇。
3.向空柱中加入10%的上柱缓冲液,静置以去除可能存在于柱壁和柱底膜上的气泡。
4.以1:1(v/v)的比例在烧杯中加入柱加载缓冲液(20 mm磷酸钠,pH 7.0,1 m NaCl),并充分混合。用玻璃棒排干并加入到柱中,用柱加载缓冲液填充剩余的柱体积。静置30分钟。
5.当所有填料都沉淀在色谱柱底部后,以小倾角将适配器插入色谱柱填料的顶部。
(1)打开色谱柱下端的开口,以10 ml/min的最大流速泵入色谱柱上样缓冲液,并压紧填料。
(2)缓慢降低缓冲液流速,用结合缓冲液(20 mM磷酸钠,pH 7.0)代替上柱缓冲液。
(3)设置蛋白纯化程序,用15倍柱体积缓冲液线性梯度洗脱目的蛋白。
(4)收集流出液,用SDS-PAGE检测。
(注:色谱所需的溶液和蛋白质样品都需要用0.22微米滤膜过滤,少量溶液或蛋白质样品需要用针式过滤器过滤,大量溶液需要用506溶剂过滤器过滤。)
结束
注:本推文首发“科研日精进” *** 公众号相关文章
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